常见细胞污染及处理方式

对于很多生物研究者来说，培养细胞重要的一点是，在培养的过程中一定要注意细胞的污染，一般来说，细胞污染不可避免，但可以减少其发生的频率和后果的严重性，所以在培养细胞的过程中一定要注意细胞培养的环境。那造成细胞微生物污染都存在哪些方面的因素以及应该注意哪些操作事项呢？

微生物污染
由于体外培养的细胞自身没有抵抗污染的能力，而在培养基中加抗生素的抗污染能力也是有限的，一般在细胞受到污染早期或污染较轻时，能及时处理并除去污染物，部分细胞还有可能得到挽救。

不同的微生物污染物对细胞的影响也有差别，微生物中支原体、黑胶虫和病毒对细胞形态和技能的影响是长期的，缓慢的和潜在的。而霉菌 和细菌增殖迅速，能在很短的时间内抑制细胞生长或产生有毒物质杀灭细胞。

霉菌污染
种类很多，污染的多是曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成淡黄色或是白色的漂浮物，一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不变混浊。
倒置显微镜下可以看见细胞之间有纵横交错穿行的丝状，树枝状或管状菌丝，并漂浮在培养液中。很多菌丝在高倍镜下可以看见链状排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形，散在细胞上及细胞周边生长。

酵母污染

酵母到处存在，并能在合适的环境中快速生长。酵母污染很容易观察到，培养物变浑浊，尤其在后期。一般PH值变化很小，严重时，PH值升高。显微镜下呈卵圆形或球形颗粒，有些会芽生较小颗粒。

处理建议：如果刚发现细胞有霉菌或酵母之类的真菌污染，推荐霉菌清除剂&念珠菌清除剂

细菌污染
细菌污染较常见的有大肠杆菌，白色葡萄球菌，假单孢菌等。加用抗菌素的培养液可预防和排除个别一般少量细菌的污染。一旦发生细菌污染很容易发现，多数情况下培养液短时间内变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显浑浊现象；有时静置的培养液起初不混，但稍加震荡，就有许多混浊物漂起。

倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮，有时在细胞表面及周围有大量细菌存在，细胞停止生长并有中毒表现。必要时可取少量培养液涂片染色检查以明确细菌种类；有的培养液改变不明显而有疑似污染，亦可向肉汤培养基内地入少量培养液，37℃培养以检测。
处理建议：双抗可以起到预防作用，一般抗生素只有抑菌作用而无杀菌效应；如果加了双抗且出现细菌污染，一般多属于耐药菌，推荐使用细胞除菌剂&杆菌清除剂

支原体污染
支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(小直径0.2um)并独立生活的微生物．约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性．可为圆形、丝状或梨形。
支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7.6-8.0)，对酸耐受性差。对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。

支原体污染细胞后．培养液可不发生混浊．多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解．因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢．甚至从培养器皿脱落。

为确定有无支原体污染可做如下检测：荧光染色法支原体检测‍、PCR法支原体检测、qPCR支原体检测、电镜检查

处理建议：支原体去除剂&支原体预防剂

黑胶虫污染

黑胶虫污染细胞后，细胞生长会变缓慢，与细胞共生，竞争营养，培养液可不发生混浊。细胞间隙内出现小黑点，会不断变多，且对各类抗生素无效，显微镜下可以看到小黑点原地跳动，细胞状态变化会因为传代、换液而有所改善，因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞空泡化，出现很多细胞碎片等。

处理建议：黑胶虫去除剂&黑胶虫预防剂

原代细胞污染处理

原代细胞在分离过程极易携带实验机体内的病原微生物或受到环境中微生物的污染，如出现培养液变浑浊、pH降低、细胞胞内颗粒、细胞变圆、易脱落，细胞间隙出现小黑点且冲洗不掉，或细胞间隙的小黑点在跳动等细胞病理状态。原代细胞一般很难获取，所以再分离提取及培养过程中，预防原代细胞污染尤为重要。

处理建议：原代细胞保护剂

细胞交叉污染
细胞污染和细菌污染不同，细胞污染是由于在培养过程中各种细胞同时进行，而所用器具或液体混杂使用所致。这种污染没有微生物存在，但使培养细胞不同种类之间发生混乱，细胞生长特性，形态发生变化。有些变化轻微，不易察觉，有些则可能由于污染的细胞具有生长优势而终压过原来细胞而导致细胞生长的抑制。污染过的细胞由于种类不纯，无法进行实验研究。

处理建议：建议实验钱对细胞进行STR鉴定

病毒污染
组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。

预防污染，从自身出发：
注意个人卫生：肥皂洗手，佩戴口罩和手套，穿着带有松紧袖口的实验服，不要随便触碰无关物品（例如：电话、门把手、摸头发等），换掉接触过动物的衣服，患有感冒的人员必须佩戴面罩。

规范操作，注重环境安全：
为您的CO₂培养箱建立一套日常的标准清洗程序，培养箱内外；

培养箱水盘定期换水；

经常检查实验室的其他设备是否受到污染（例如：洗手池/离心机/水浴锅等）；
限制使用同一培养箱的人数。
       

定期检测，排除潜在污染：
细胞培养需要定期检测支原体，细菌，真菌等污染，细胞污染做到早发现，早处理，提高细胞存活率；
不要混用、共享培养皿或培养基；
不要令盛放培养基的容器开口放置过长时间；
细胞培养过程用到的可高压灭菌物品需高压灭菌消毒；

尽量使用一次性预灭菌培养耗材。