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人肺腺癌细胞提取

作者：小刀浏览数:6次
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样本处理：
















































1、原代细胞保护剂（ZF706-01)、双抗和 PBS按照比例进行配制，用来清洗标本。
2、取回来的标本用吸枪吸走培养基，吸完之后用配好的原代细胞保护剂（ZF706-01)、双抗的 PBS 清洗两次，洗掉血水，剔除正常组织及间质，留下较纯的肿瘤组织。
3、洗完之后，在冰块上放上 10cm 的培养皿，将洗好的组织加入 PBS 倒入其中。



















































4、原代制作：10cm 培养皿中的组织用镊子夹入另外一个干净的 10cm 培养皿中 （如果有 PBS，用刀片切标本会滑，切不动）使用双面刀片切碎（泥状），Hank’s平衡盐溶液稀释胶原酶Ⅰ型（ZF301-02）， 透明质酸酶 和 Dnase Ⅰ 型 中加入切碎的组织中，重悬组织，吸入 15ml 的离心管中。37°孵箱中旋转孵育 40-60min，时间视细胞团块大小而定。
5、孵育之后加入 2-3 倍体积的培养基（DMEM +20%胎牛血清优级+双抗+原代细胞保护剂（ZF706-01)）终止消化，将 70um 的细胞筛放在 50mL 的离心管上，用 1ml 的枪头将细胞悬液吸起过滤，将滤 过的细胞悬液分装到 15ml 离心管中，950rpm/15min（D/R=10)
6、向 15ml 离心管中加入 1ml percoll细胞分离液重悬细胞后，再加入剩下 3ml percoll细胞分离液，再次吹匀细胞悬液；向细胞混合液中缓慢持续加入 4-5ml PBS（离液 面较近沿管壁缓慢按住枪头加，3min 左右加完 1ml），共加入 4ml PBS。800g 离心 20min,缓慢升降速（D/R=10).



















































7、若标本颜色乳白，红细胞较少，则不进行裂红，若标本较红，血细胞较多， 则进行裂红，过滤过的水（4℃）配制 1X 裂红液（放置室温）。细胞离好后，弃上清，每管加入 1ml 裂红液，裂红 60-90s，不超过 2min，裂好 后立即加入 4ml PBS 终止，950rpm/15min。
8、弃上清，加入 4ml PBS，950rpm/15min.
9、弃上清，加入 4ml 完全培养基，950rpm/15min.
10、弃上清，用 1ml 全培养基重悬细胞，在 6 孔板中加入 1ml 培养基，加入细胞 悬液，放入 37°孵箱中培养。每天观察，隔天换液，5-8 天传代（视细胞情况）。

END


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