1. 细胞基本特性
• 来源与背景
源自NIH Swiss小鼠胚胎，经多轮亚克隆筛选，为高度接触性抑制的成纤维样贴壁细胞。对病毒转化（如肉瘤病毒）和DNA转染敏感，广泛用于转化实验和肿瘤研究。
• 生长特性
• 培养基：DMEM + 10% 胎牛血清（FBS） + 1% 青霉素/链霉素（P/S）。
• 培养条件：37℃、5% CO₂，气相为95%空气 + 5% CO₂。
• 倍增时间：约20小时，贴壁生长需2~3次/周换液。
2. 细胞传代步骤
当细胞汇合度达80%~90%时进行传代（通常接种后3~4天）：
1. 弃培养基：吸除旧培养基，用PBS（不含钙/镁离子）清洗细胞1~2次。
2. 消化：加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（1 mL/T25瓶），37℃孵育1~3分钟，显微镜下观察至细胞变圆脱落。
3. 终止消化：加入等体积含血清的完全培养基，吹打混匀后转移至离心管，1000 rpm离心5分钟。
4. 重悬与分瓶：弃上清，用新鲜培养基重悬，按 1:2~1:4 比例分瓶（如1瓶分至2~4瓶）。
⚠️ 关键提示：首次传代建议1:2比例，避免过度稀释影响生长。
3. 细胞冻存与复苏
• 冻存步骤：
1. 消化收集细胞，离心后计数。
2. 用冻存液（55%基础培养基 + 40% FBS + 5% DMSO）重悬，密度调至5×10⁶~1×10⁷ cells/mL。
3. 分装至冻存管，程序降温：
◦ -20℃ 1.5小时 → -80℃ 过夜 → 液氮长期保存。
• 复苏步骤：
1. 37℃水浴快速解冻（≤1分钟），酒精消毒冻存管。
2. 转移细胞悬液至含6 mL培养基的离心管，1000 rpm离心5分钟。
3. 弃上清，用新鲜培养基重悬，接种至培养瓶，37℃静置4小时后再换液。
4. 细胞接收与初期处理
• 检查包装：确认无漏液、破损，干冰未完全挥发。
• 静置与观察：
1. 75%酒精擦拭培养瓶，显微镜下拍照记录（40×~200×）。
2. 贴壁细胞：静置培养箱3~4小时稳定状态；悬浮细胞：离心后重悬培养。
3. 若汇合度＞80%，直接传代；＜80%则补液继续培养。
5. STR鉴定与质量控制
• 必要性：STR鉴定为细胞身份验证的金标准，防止交叉污染（小鼠细胞错误识别率高达20%）。
• 检测标准：
• 小鼠细胞：需检测18个STR位点（如1-1、4-2、X-1等） + 1个人源位点（TH01）排除污染。
• 匹配要求：与数据库（如Cellosaurus、ATCC）比对，≥80%位点一致（需结合细胞表型验证）。
• 检测频率：
• 新细胞入库时、冻存前后、长期培养中每3~6个月一次。
6. 常见问题与注意事项
• 污染防控：
• 支原体/细菌检测阴性（见细胞报告），操作需在二级生物安全柜中进行。
• 培养液浑浊或pH骤变（桃红色→黄色）提示污染，需废弃。
• 生长异常处理：
• 细胞老化：轮廓增强、空泡化 → 降低传代密度或更换血清批次。
• 消化过度：缩短胰酶作用时间，预冷PBS终止。
